蛋白质磷酸化作用的定量评定0桂林
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蛋白质磷酸化作用的定量评定
蛋白质磷酸化作用的定量评定 2011年12月04日 来源： 蛋白质磷酸化作用是调节细胞信号的关键步骤。应用红外成像技术，开发了一个可以定量蛋白质磷酸化作用的人工培养的细胞阵列格局，而且可以用来测量药理学的50％抑制浓度。 异常的磷酸化作用在许多疾病作用过程中都扮演了角色，例如癌症、糖尿病致视网膜病、风湿性关节炎和帕金森氏症等疾病。因而当前许多正在开发的新药便以抑制蛋白质激酶为目标。开发这种药物是一项耗时且代价高昂的过程。现在有许多种筛选激酶抑制药物的方法。生物化学检验，虽然很容易就能适应高通道筛选，但是由于这种化验并没有提出诸如药物进入细胞的能力、药物毒性这种问题，或者由于在生物体外化验的特性所导致的后生物繁殖问题，常常会产生大比例的错误结果。Li-cor开发了一种新型的基于荧光免疫细胞化学的检验方法，称之为In-cell Western。这种化验方法在一个拥有96孔或者384孔的平板上进行，而且不需要细胞提取物。使用候选药物对微量滴定板上的人工培养细胞进行处理，然后引入需要的蛋白质激酶信号途径。细胞是固定的，可以通过标准的免疫细胞化学方法进行渗透处理。同时引入两种不同物种派生的初级抗体。一种初级抗体对准泛目标蛋白质或者“看家蛋白”。另一种抗体对准磷酸铵基酶的目标蛋白质。然后，将两种初级抗体分别用Alexa Fluor 680和 IRDye 800（两种荧光染料）标定形成二级抗体，引入体系。对每个微量滴定的样品池中发出的荧光总量，可以采用Odyssey红外成像仪在700nm和800nm波长处进行定量测量（图1）。
结果和讨论首先应检查In-Cell Western检验中所使用的抗体的特异性和先前提到的Western双色印记不存在乱真谱带。为了通过实验说明In-Cell Western检验在药物表征中测定IC50（抑制浓度）值时的效用，对PD168393数目的增加进行了监测，这种增加响应了药物对细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化作用的抑制。PD168393是一种已知的表皮生长因子受体（EGFR），是细胞外信号调节激酶（ERK）指令级中的一员。使用越来越浓的PD168393对384孔人工培养的人体A431细胞实验盘进行预处理，并且使用100 ng/ml的表皮生长因子（EGF）溶液进行刺激。细胞是固定的，使用清洁剂处理浸透，易于免疫染色。细胞外信号调节激酶（ERK）的总量通过联合分析对兔抗-ERK和IRDye800 CW标记的羊抗兔抗体而得到。含磷的ERK的量通过含磷的鼠抗ERK和Alexa Flour 680标记的羊抗鼠的量进行计算。在EGF存在而PD168393 不存在的情况下，细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化作用有了实质性的增加。依赖于加入样品的PD168393 的剂量的多少，观察到了磷酸化作用的剂量的相关减小。根据ERK总量标准化处理过的ERK的磷酸化作用确保了准确、可重复定量测定PD168393 的效用以及测定药物的50％抑制浓度。In-Cell Western 可以得到PD168393 准确的IC50值，其值与文献中所叙述的IC50值相符。总结In-Cell Western Assay依赖于双色的红外检测；可以得到准确、高度可重复的实验数据；而且和Western blotting相比，不需要密集的工作，也不存在由于细胞提取所带来的潜在的假象。避免进行细胞提取这点尤为重要，因为有些含磷蛋白质是不稳定的，在处理过程中的去磷酸化会导致错误的结果。与基于酶-底物的化学反应的化学发光法不同的是，红外荧光检测是一种有着超过4000-fold 线性范围的直接定量方法。In-Cell Western 检测可以以便利的微量滴定板的形式，在不需要细胞提取和电泳分离的情况下，对药物作用于蛋白质激酶靶体的效果做出准确的定量评价。事实将证明，这种检测方法在检验激酶抑制药物功效中是非常有用的。(end)